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幾種常見(jiàn)的拉曼技術(shù)

共振拉曼(RRS)

如果激光的波長(zhǎng)和分子的電子吸收相吻合，這一分子的某個(gè)或幾個(gè)特征拉曼譜帶強(qiáng)度將增至100-10,000 倍以上，并觀察到正常拉曼效應(yīng)中難以出現(xiàn)的、其強(qiáng)度可與基頻相比擬的泛音及組合振動(dòng)光譜。這種共振增強(qiáng)或共振拉曼效應(yīng)非常有用，不僅能顯著降低檢測(cè)限，而且可引入電子選擇性。由于共振拉曼能提供結(jié)構(gòu)及電子等信息，因此，共振拉曼也被用于物質(zhì)鑒定。

紫外共振拉曼(UVRRS)

熒光干擾問(wèn)題和靈敏度較低嚴(yán)重阻礙了常規(guī)拉曼光譜的廣泛應(yīng)用。但近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的紫外拉曼光譜技術(shù)有效地解決了上述問(wèn)題。紫外拉曼光譜技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展大大地?cái)U(kuò)展了拉曼光譜的應(yīng)用范圍。右圖是紫外拉曼光譜避開(kāi)熒光干擾的原理圖。熒光往往出現(xiàn)在300 nm-700 nm 區(qū)域，或者更長(zhǎng)波長(zhǎng)區(qū)域。而在紫外區(qū)的某個(gè)波長(zhǎng)以下，熒光少出現(xiàn)。因此，對(duì)于許多在可見(jiàn)拉曼光譜中存在強(qiáng)熒光干擾的物質(zhì)，例如氧化物、積碳等， 通過(guò)利用紫外拉曼光譜技術(shù)就可以成功的避開(kāi)熒光從而得到信噪比較高的拉曼譜圖。從下圖磷酸鋁分子篩ALPO-5 示例可以看出，紫外共振拉曼光譜技術(shù)由于能避開(kāi)熒光，可以成功用于微孔和介孔分子篩材料的表征。

紫外拉曼光譜技術(shù)的另一個(gè)突出特點(diǎn)是，拉曼信號(hào)可以通過(guò)共振拉曼信號(hào)得到增強(qiáng)。共振拉曼效應(yīng)可以從拉曼散射截面公式得到解釋?zhuān)焊鶕?jù)Kramers-Heisenberg-Dirac 散射公式:

在公式 (1) 中，ωri 是初始態(tài)i 到激發(fā)態(tài)r 的能量差頻率，ωL 是入射激光頻率。當(dāng)激發(fā)光源頻率靠近電子吸收帶時(shí)，*項(xiàng)分母趨近于零，因而其散射截面異常增大, 導(dǎo)致某些特定的拉曼散射強(qiáng)度增加104~106 倍。共振拉曼光譜的譜峰強(qiáng)度隨著激發(fā)線的不同而呈現(xiàn)出與普通拉曼不同的變化。

紫外拉曼光譜規(guī)避熒光成功表征AIPO-5 分子篩的信號(hào)

將紫外共振拉曼用于表征多組份體系時(shí)，可以選擇性的激發(fā)某些組分相應(yīng)的信息，從而使與這些組分相關(guān)的拉曼信號(hào)大大增強(qiáng)，得到共振拉曼光譜

這種共振增強(qiáng)或者共振拉曼效應(yīng)是非常有用的一個(gè)技術(shù)，它不僅可以大的降低拉曼測(cè)量的探測(cè)限，而且還可以引入到電子選擇上面。這樣，如果我們使用共振拉曼技術(shù)來(lái)研究樣品，不僅可以看到它的結(jié)構(gòu)特征，而且還可以得到它的電子結(jié)構(gòu)信息。金屬卟啉， 類(lèi)胡蘿卜素以及其他一系列生物重要分子的電子能級(jí)之間躍遷能量差都處在可見(jiàn)光范圍之內(nèi)，這使得它們成了共振拉曼光譜的理想研究材料。

拉曼散射和共振拉曼散射的能級(jí)圖以及它們對(duì)應(yīng)拉曼譜圖示意圖

共振選擇技術(shù)還有一個(gè)非常實(shí)際的應(yīng)用。那就是二分之一載色體的光譜由于這種共振作用會(huì)得到增強(qiáng)，而它周?chē)沫h(huán)境則不會(huì)。對(duì)于生物染色體來(lái)說(shuō)這就意味著，我們使用可見(jiàn)光即可特定的探測(cè)到有源吸收中心，而它們周?chē)牡鞍踪|(zhì)陣列則不會(huì)對(duì)探測(cè)產(chǎn)生影響（這是因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)需要紫外光才能使其產(chǎn)生共振增強(qiáng)作用）。共振拉曼光譜在化學(xué)上探測(cè)金屬中心合成物，富勒分子，聯(lián)乙醯以及其他的稀有分子上也是一種重要的技術(shù)，因?yàn)檫@些材料對(duì)于可見(jiàn)光都有著很強(qiáng)的吸收。

其他更多的分子吸收光譜由于處于紫外，所以需要紫外激光進(jìn)行共振激發(fā)，我們就稱之為紫外共振拉曼（Ultra Violet Resonance Raman Spectroscopy）; 紫外共振拉曼光譜技術(shù)是研究催化和復(fù)雜生物系統(tǒng)中分子分析的一個(gè)重要工具。大多數(shù)的生物系統(tǒng)都吸收紫外輻射， 所以它們都能提供紫外的共振拉曼增強(qiáng)。這樣高的共振拉曼共振選擇效應(yīng)使得像蛋白質(zhì)和DNA 等重要生物目標(biāo)的拉曼光譜得到大增強(qiáng)， 而其他物質(zhì)則不會(huì)，非常便于目標(biāo)確認(rèn)及分析。例如，200nm 的激發(fā)光能夠增強(qiáng)氨基化合物的振動(dòng)峰；而220nm 的激發(fā)光則可以增強(qiáng)特定的芳香族殘留物的振動(dòng)峰。水中的拉曼散射非常弱，這個(gè)技術(shù)使得與水有關(guān)的微弱系統(tǒng)的拉曼分析也變成了可能。

金屬卟啉、類(lèi)胡蘿卜素以及其他幾類(lèi)重要的生物分子在可見(jiàn)光區(qū)域內(nèi)有強(qiáng)烈的電子躍遷，因此他們成了理想的共振拉曼光譜檢測(cè)對(duì)象。

表面增強(qiáng)拉曼（SERS）

自1974 年Fleischmann 等人發(fā)現(xiàn)吸附在粗糙化的Ag 電表現(xiàn)的吡啶分子具有巨大的拉曼散射現(xiàn)象，加之活性載體表面選擇吸附分子對(duì)熒光發(fā)射的抑制，激光拉曼光譜分析的信噪比大大提高，這種表面增強(qiáng)效應(yīng)被稱為表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)。

拉曼散射由化合物（或離子）的散射吸附，或在結(jié)構(gòu)化金屬表面，可達(dá)到溶液中散射的103 倍到106 倍。這種表面增強(qiáng)拉曼散射在銀表面表現(xiàn)得zui強(qiáng)，在金或銅表面也比較強(qiáng)。其他金屬則沒(méi)有這么強(qiáng)的增強(qiáng)效應(yīng)。

表面增強(qiáng)效應(yīng)產(chǎn)生的兩個(gè)機(jī)制：

*種是在貴金屬表面產(chǎn)生一種增強(qiáng)的電磁場(chǎng)。當(dāng)入射光的波長(zhǎng)接近金屬等離子體波長(zhǎng)時(shí)，金屬表面?zhèn)鲗?dǎo)電子被激發(fā)到一個(gè)擴(kuò)展表面的電子激發(fā)態(tài)，稱為表面等離子體共振。分子吸附在表面或接近表面經(jīng)過(guò)一個(gè)異常大的電磁場(chǎng)。垂直于表面的振動(dòng)模式帶來(lái)的增強(qiáng)zui強(qiáng)烈。

第二種是是在表面和分析物分子之間形成電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物。許多電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物帶來(lái)的電子躍遷會(huì)產(chǎn)生可見(jiàn)光，以便發(fā)生增強(qiáng)諧振。

顯微共聚焦拉曼（Confocal）

共焦：從一個(gè)點(diǎn)光源發(fā)射的探測(cè)光通過(guò)透鏡聚焦到被觀測(cè)物體上，如果物體恰在焦點(diǎn)上，那么反射光通過(guò)原透鏡應(yīng)當(dāng)匯聚回到光源， 這就是所謂的共聚焦，簡(jiǎn)稱共焦。共焦指的是空間濾波的能力和控制被分析樣品的體積的能力，通常是利用顯微鏡系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。只有顯微鏡系統(tǒng)的無(wú)限遠(yuǎn)光路才可以實(shí)現(xiàn)良好的共焦性能。

顯微拉曼光譜技術(shù)是將拉曼光譜分析技術(shù)與顯微分析技術(shù)結(jié)合起來(lái)的一種應(yīng)用技術(shù)。與其他傳統(tǒng)技術(shù)相比，更易于直接獲得大量有價(jià)值信息，共聚焦顯微拉曼光譜不僅具有常規(guī)拉曼光譜的特點(diǎn)，還有自己的*優(yōu)勢(shì)，樣品區(qū)接近衍射限（約1 微米）；成像和光譜可以被組合以產(chǎn)生“拉曼立方體”三維數(shù)據(jù)，在二維圖像的每個(gè)像素對(duì)應(yīng)一個(gè)拉曼頻譜信息。

從光學(xué)結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)，顯微共聚焦拉曼光譜儀主要有針孔共聚焦和“狹縫-CCD”共聚焦兩種設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)。

先進(jìn)的“狹縫+CCD 焦平面共焦”技術(shù)，具有較高通光效率，高靈敏度，操作簡(jiǎn)單。

原理：顯微鏡頭聚焦到樣品上，將顯微鏡頭收集的樣品信號(hào)聚焦到光譜儀狹縫入口，通過(guò)狹縫對(duì)焦平面的一維（X 方向）限制進(jìn)入光譜儀； 經(jīng)光譜儀分光，光譜成像在CCD 上；在通過(guò)對(duì)CCD 上像元的提取， 對(duì)另一維（Y 方向）的信號(hào)的限制，提取出樣品上的信號(hào)，實(shí)現(xiàn)共焦作用。“狹縫+CCD 焦平面共焦”技術(shù)特點(diǎn)：

1、 共焦區(qū)域任意設(shè)置（狹縫寬度，CCD 像元區(qū)域任意設(shè)定）。

2、 全部信號(hào)進(jìn)入光譜儀，沒(méi)有信號(hào)損失。

采用“狹縫+CCD焦平面共焦”技術(shù)的Finder Vista（“微曼”共聚焦拉曼顯微鏡）空間分辨率指標(biāo)：

 X，Y方向空間分辨率：1um

 Z方向空間分辨：2um